Chymotrypsin được tổng hợp trong tuyến tụy bằng quá trình sinh tổng hợp protein như một tiền chất gọi là chymotrypsinogen, enzyme bất hoạt. Trypsin kích hoạt chymotrypsinogen bằng cách cắt liên kết peptid ở các vị trí Arg15 - Ile16 và tạo ra π-chymotrypsin. Đổi lại, nhóm aminic (-NH3+) của dư lượng Ile16 tương tác với chuỗi bên của Glam194, tạo ra "lỗ oxyener" và "túi S1" kỵ nước. Chymotrypsin kích hoạt chính nó bằng cách phân cắt ở các vị trí 14-15, 146-147 và 148-149, tạo ra α-chymotrypsin (hoạt động mạnh và ổn định hơn so với π-chymotrypsin). [cần dẫn nguồn] Phân tử thu được là phân tử chứa ba polypeptide liên kết với nhau thông qua liên kết disulfide.